Видовая идентификация бактерий методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК, роль и место метода в диагностике бактериальных инфекций Выполнила: Савельева Ксения, Выполнила: Савельева Ксения, ученица 11 специализированного класса ученица 11 специализированного класса МБОУ Краснообской СОШ 1 МБОУ Краснообской СОШ 1 Научный руководитель: Научный руководитель: канд. биол. наук Афонюшкин Василий Николаевич канд. биол. наук Афонюшкин Василий Николаевич

Задачи: 1. Освоить метод электрофореза ДНК в геле агарозы 2. Освоить метод анализа результатов секвенирования и провести построение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16 S рибосомальной РНК полученных изолятов рода Bacillus 1. Освоить метод электрофореза ДНК в геле агарозы 2. Освоить метод анализа результатов секвенирования и провести построение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16 S рибосомальной РНК полученных изолятов рода Bacillus 3. Изучить перспективы совместного использования методов секвенирования и биохимической идентификации бактерий 3. Изучить перспективы совместного использования методов секвенирования и биохимической идентификации бактерий Цель исследования: Изучить возможности метода видовой идентификации бактерий методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК в сочетании с традиционными методами идентификации

Материалы и методы Чистые культуры изолятов высевали на МПА и после часов инкубации готовили бактериальную взвесь на фосфатно-солевом буфере. Культуры окрашивали по Грамму и микроскопировали. Оценивали следующие биохимические свойства: Утилизация цитрата, малоната, глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, фенилаланина, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарабинола (Реакция Фогес- Проскауэра), наличие бета-галактозидазы, уреазы, декарбоксилаз аргинина и лизина, гидролазы аргинина. Культуры тестировали на каталазную, цитохромоксидазную активности, образование нитритов, синтез пигментов, антибиотикорезистентность, изучали культуральные и морфологические свойства. Бетта-галактозидазную, тритофандезаминазную и глюкоронидазную активности проверяли на среде Уриселект 4 (BioRad).ДНК выделяли фенолхлороформенным методом, вид определяли на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНКи межгенного спейсера 16-23S рибосомальной РНК и совокупности биохимических, культурных и морфологических признаков.

Культуральные свойства: выросшие культуры не росли на среде Эндо т.е. не относились к энтеробактериям, росли на мясопептонном агаре а аэробных условиях при 37С Тинкториальные свойства: выросшие культуры исследовали микроскопически и окрашивали по Граму, что позволило установить что полученные культуры относятся к спорообразующим Гр+ палочкам Характеристики культур

Раствор с праймером распределяют по 4 пробиркам, в каждой из которых находятся 4 дезоксинуклеотида dАТР,dСТР, dТТР(один из них –меченный радиоктивным изотопом) и один из четырех 2;3- дидезоксинуклеотидов(ddАТР,ddТТР,ddGTP,dd СТР) Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигнуклеотидов разной длины, включающих праймеровую последовательность. Далее в пробирки добавляют формалид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриловом геле на четерых дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть»нуклеиновую последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул белков и нуклеиновых кислот (а также их фрагментов). Различают множество разновидностей этого метода. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.белковнуклеиновых кислот Электрофорез это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля.электрокинетическое явлениеэлектрического поляЭлектрофорез Схема исследований: продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в агарозном геле. Метод Сэнгера

Результаты биохимических исследований культур с использованием тестов ПБДЭ Биохимические свойства штамма B.licheniformis: утилизация цитрат отрицательно, малонат отрицательно, цитрат натрия +глюкоза отрицательно, лизин отрицательно, аргинин отрицательно, орнитин отрицательно, фенилаланин отрицательно, индол отрицательно, ацетилметилкарабинол положительно уреаза отрицательно, сероводород отрицательно, глюкоза положительно, б-галактозидаза положительно, лактоза отрицательно, манит положительно, сахароза положительно, инозит положительно, сорбит положительно, мальтоза положительно

Заключение Видовая идентификация микроорганизмов на основе секвенирования может являться «золотым стандартом» лабораторной диагностики, однако точность метода ограничена достоверностью и полнотой баз данных GenBank и, следовательно, требует дополнительного использования подтверждающих тестов.

Вторичная структура 16S рРНК E. coli – один из трех типов рибосомной РНК (рРНК), локализующиеся в рибосомах прокариот. Имеют среднюю величину среди этих рРНК. Константа седиментации равна 16S (единиц Сведберга), для других рРНК константы уровне 5 и 23 S. В состав 16S рРНК входит 1600 нуклеотидов. У эукариот существуют аналогичные ей 18S рРНК, состоящие из 2500 нуклеотидов.
Атомная структура 30S Subunit в Thermus thermophilus. Протеины показано синим цветом, в то время как единичную полоску РНК показано оранжевым. Рибосомы и РНК присутствуют во всех без исключения клетках, а также некоторых органеллах эукариот (митохондрии, хлоропласты), т.е. эти структуры характеризуются древнейшим происхождением. Их функции всегда одинаковы, а первичная структура имеет высокую степень консервативности. Также рРНК находятся вне действия естественного отбора, поэтому молекулы эволюционируют только в результате спонтанных мутаций и количество этих мутаций может служить критерием эволюционной расстояния между организмами.
Из трех типов рРНК 16S и 18S удобнее анализировать, к настоящему времени изучена последовательность нуклеотидов в 16S и 18S рРНК для многих сотен видов из разных царств живой природы. На основании полученных данных выделено три группы эволюционно сходных организмов, получивших высший ранг доменов. Это:

Эукариоты (но не их органеллы),
Бактерии (а также митохондрии и хлоропласты эукариот),
Археи.

Исследования родства среди бактерий показали наличие 10 эволюционных ветвей, причем в 5 из них обнаружены фотосинтезирующие организмы. То есть они намного более родственны другим нефотосинтезуючим бактериям, чем друг другу. Эти открытия заставляют по-новому смотреть на эволюцию одноклеточных организмов и возникновение фотосинтеза.

domains of 16S rRNA: central domain, 3’ major domain, 3’ minor domain, 5’ domain - домены 16S-рРНК.

Четыре элемента вторичной структуры 16S-рРНК, входящей в состав большой РНК малой субчастицы рибосом прокариот; модель Д.16S-рРНК составлена с учетом наличия консервативных функциональных последовательностей нуклеотидов; выделяют центральный домен, 5’-домен, малый и основной 3’-домены.

(Источник: «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд-во ВНИРО, 1995 г.)

• - , области химически однородной среды, отличающиеся электрич., магн. или упругими свойствами, либо упорядоченностью в расположении частиц...

  Физическая энциклопедия

• - см. Акустоэлектрические домены...

  Физическая энциклопедия

• - см. Антиферромагнитные домены...

  Физическая энциклопедия

• - области полупроводника с разным уд. электрич. сопротивлением и разной напряжённостью электрич...

  Физическая энциклопедия

• - области с разл. спонтанной, или собственной, деформацией, возникающие в твёрдой фазе при её образовании внутри или на поверхности другой твёрдой фазы. Наблюдаются при мартенситном...

  Физическая энциклопедия

• - одна из 3 наиболее изученных РНК - одноцепочечная, собирается в серию сложных форм, которые соединяются со специфическими белками в рибосомы...

  Начала современного Естествознания

• - ribosomal RNA, rRNA - рибосомная РНК, .РНК, входящая в состав рибосом; кодируется генами, локализованными в районе ядрышкового организатора ...

  Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь

• - однородные области кристалла, различающиеся мат., электрич. или упругими свойствами либо упорядоченностью в расположении или ориентации частиц...

  Естествознание. Энциклопедический словарь

• Медицинская энциклопедия

• - см. Рибонуклеиновая кислота рибосомная...

  Большой медицинский словарь

• - 1) Д. ферромагнитные - самопроизвольно намагниченные до насыщения части объёма ферромагнетика, на к-рые он разбивается при темп-pax ниже Кюри точки...

  Большой энциклопедический политехнический словарь

• - области самопроизвольного намагничивания до насыщенной части объема ферромагнетика, на которые он разбивается ниже температуры Кюри. Векторы намагничивания доменов без внешнего магнитного поля...

  Энциклопедический словарь по металлургии

• - так называются в Зап. Европе государственные имущества, а в некоторых государствах - имущества, принадлежащие государю или предоставленные в его пользование...

  Энциклопедический словарь Брокгауза и Евфрона

• - области однородной среды, отличающиеся магнитными, электрическими или упругими свойствами либо упорядоченностью в расположении или ориентации частиц...

  Большой энциклопедический словарь

• - дом"ены, -ов, ед. ч. дом"...

  Русский орфографический словарь

• - В зап. Европе - уделы земли, доходы с которых принадлежат государству или членам династии...

  Словарь иностранных слов русского языка

"домены 16S-рРНК" в книгах

Вакуумные (эфирные) домены

Из книги Солнечный ветер автора Тихоплав Виталий Юрьевич

Вакуумные (эфирные) домены Современные физические теории не могут объяснить суть природных самосветящихся образований, вход этих образований в твердые тела и воду, а также их прохождение через указанные среды. В этой связи оказываются несостоятельными

XVI. Великокняжеские домены и их тяглое население при Казимире и его сыновьях

Из книги Очерк истории Литовско-Русского государства до Люблинской унии включительно автора Любавский Матвей Кузьмич

XVI. Великокняжеские домены и их тяглое население при Казимире и его сыновьях Происхождение господарских имений. Значение их как материальной опоры великокняжеской власти и государственных имуществ. Господарское хозяйство в доменах; дворы и дворцы. Челядь дворная; ее

Домены

Из книги Большая Советская Энциклопедия (ДО) автора БСЭ

Цилиндрические магнитные домены

Из книги Большая Советская Энциклопедия (ЦИ) автора БСЭ

Предисловие Домены древности и наших дней

автора Венедюхин Александр

Предисловие Домены древности и наших дней В стародавние времена, когда люди не знали еще даже текстового Интернета, сети связи были другими: к ним относились, например, дороги, по которым гонцы разносили грамоты с сообщениями и приказами. Доменами тогда называли огромные

Глава 6 Страны, коды и домены

Из книги Домены. Все, что нужно знать о ключевом элементе Интернета автора Венедюхин Александр

Глава 6 Страны, коды и домены Национальными доменами называют двухбуквенные домены первого уровня, соответствующие кодам, обозначающим государства. Например, домен RU – национальный домен России; домен DE – национальный домен Германии; UZ – национальный домен Узбекистана.

RUсские домены

Из книги Домены. Все, что нужно знать о ключевом элементе Интернета автора Венедюхин Александр

RUсские домены История с кириллицей в домене RU, несомненно, уже вошла в летопись Рунета и показательна сразу во многих аспектах.О возможности введения кириллических имен в домене RU заговорили очень давно, еще в конце 90-х годов XX века. Более того, пока одни участники рынка

Глава 11 Безопасность и домены

Из книги Домены. Все, что нужно знать о ключевом элементе Интернета автора Венедюхин Александр

Глава 11 Безопасность и домены Безопасность систем адресации Интернета – очень актуальная и живо обсуждаемая в профильных сообществах тема. Только по проблемам безопасности DNS за последние годы написано множество научных трудов. Это неудивительно: DNS лежит в основе

Домены приложений.NET

Из книги Язык программирования С# 2005 и платформа.NET 2.0. автора Троелсен Эндрю

Домены приложений.NET Теперь, когда вы понимаете роль процессов Win32 и возможностей взаимодействия с ними средствами управляемого программного кода, давайте рассмотрим понятие домена приложения.NET. По правилам платформы.NET компоновочные блоки не размещаются в рамках

2. Домены и атрибуты

Из книги Базы данных: конспект лекций автора Автор неизвестен

2. Домены и атрибуты Домены и атрибуты – базовые понятия в теории создания баз данных и управления ими. Поясним, что же это такое.Формально, домен атрибута (обозначается dom(a)), где а – некий атрибут, определяется как множество допустимых значений одного и того же типа

автора Борри Хелен

ЧАСТЬ III. Типы данных Firebird и домены

Домены

Из книги Firebird РУКОВОДСТВО РАЗРАБОТЧИКА БАЗ ДАННЫХ автора Борри Хелен

Домены В Firebird вы можете сделать предварительное объявление столбца с типом данных и "шаблонным набором" атрибутов в виде домена. Как только домен будет создан и подтвержден (commit), он может быть использован в любой таблице вашей базы данных, как если бы он был типом данных.! !

ГЛАВА 13. Домены.

Из книги Firebird РУКОВОДСТВО РАЗРАБОТЧИКА БАЗ ДАННЫХ автора Борри Хелен

ГЛАВА 13. Домены. Домены в Firebird сродни концепции "типы данных, определенные пользователем". Хотя и невозможно создать новый тип данных, в домене вы можете "упаковать" набор атрибутов с одним из существующих типов данных, присвоить ему идентификатор и после этого

Когда домены не работают

Из книги Firebird РУКОВОДСТВО РАЗРАБОТЧИКА БАЗ ДАННЫХ автора Борри Хелен

Когда домены не работают Домен не может быть использован:* в функции CAST (<имя_домена> AS <другой_тип>);* вместо явного типа данных при определении входных и выходных аргументов хранимых процедур;* при объявлении типа данных локальной переменной в триггере или хранимой

2.2.7. Домены

Из книги BPwin и Erwin. CASE-средства для разработки информационных систем автора Маклаков Сергей Владимирович

2.2.7. Домены Домен можно определить как совокупность значений, из которых берутся значения атрибутов. Каждый атрибут может быть определен только на одном домене, но на каждом домене может быть определено множество атрибутов. В понятие домена входит не только тип данных, но

16S рРНК — один из трех типов рибосомной РНК (рРНК), которые локализуются в рибосомах прокариот. Имеют среднюю величину среди этих рРНК. Константа седиментации равна 16S (единиц Сведберга) для других рРНК константы уровне 5 и 23 S. В состав 16S рРНК входит 1600 нуклеотидов. У эукариот существуют аналогичные ей 18S рРНК, состоящие из 2500 нуклеотидов.

Рибосомы и РНК присутствуют во всех без исключения клетках, а также некоторых органеллах эукариот (митохондрии, хлоропласты), то есть эти структуры характеризуются древнейшим происхождением. Их функции всегда одинаковы, а первичная структура имеет высокую степень консервативности. Также рРНК находятся вне действия естественного отбора, поэтому молекулы эволюционируют только в результате спонтанных мутаций и количество этих мутаций может служить критерием эволюционной расстояния между организмами.

Из трех типов рРНК 16S и 18S удобнее анализировать, до сих пор изучена последовательность нуклеотидов в 16S и 18S рРНК для многих сотен видов из разных царств живой природы. На основании полученных данных выделено три группы эволюционно сходных организмов, получивших высший ранг доменов. Это:

• Эукариоты (но не их органеллы),
• Бактерии (а также митохондрии и хлоропласты эукариот),
• Археи.

Исследование родства среди бактерий показали наличие 10 эволюционных ветвей, причем в 5 из них обнаружены фотосинтезирующие организмы. То есть последние гораздо более родственные другим нефотосинтезирующие бактериям, чем друг другу. Эти открытия заставляют по-новому смотреть на эволюцию одноклеточных организмов и возникновение фотосинтеза.