Лекция № 2. Биотехнология животных

1. Культивирование животных клеток

Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов-вирусов. Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до времени, когда: 1) стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и 2) подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости были одинаковыми. Причины и следствия этих двух феноменов в настоящее время интенсивно исследуются и они знаменуют собой начало четвертого этапа работ в данной области.

Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. Особенности их приведены ниже.

1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.

2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.

3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.

4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма.

Чуть позже, в 1885 году, У. Ру (W. Roux) показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Впоследствии он стал автором, активно публиковавшимся по проблемам эмбриологии in vitro. Позднее, в 1897 г., Лёб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. Дополнительные эксперименты были проведены Джолли (1903), наблюдавшим деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты саламандры, а Биб и Эвинг (1906) подтвердили это при пересадке лимфосаркомной ткани собаки.

Продолжая работы Ру, Росс Харрисон усовершенствовал методику «висячей капли». Он использовал небольшие кусочки ткани, отторгнутые от медуллярного сосуда лягушки к внедренные в ее лимфатический тромб, и выдерживал их в виде капли на нижней стороне покровного стекла, расположенного поверх углубления в предметном стекле. В 1907 г. ему удалось наблюдать с помощью такой «камеры» рост нервных клеток в течение нескольких недель; он установил, что скорость роста этих клеток составляет 20 мкм за 25 мин. В то время как эксперименты Харрисона были направлены на то, чтобы получить ответы на вопросы, относящиеся к физиологии нервных клеток лягушки, методика, которой он пользовался, была применена Барроузом для других клеток тканей теплокровных животных. Этот исследователь в 1910 г. вместо лимфатического тромба использовал тромб плазмы курицы.

В 1913 г. Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Добавка такого экстракта ускоряла рост тканей. Примененная методика обеспечивала значительно большую вероятность успеха, чем та, которую использовали Левис (1911) и Рид (1908 г.). Рид готовила культуры клеток из костного мозга морской свинки и пыталась выращивать эксплантаты на среде определенного химического состава. Работа Карреля привлекла большое внимание, так как она была опубликована под интригующим названием - культивирование «бессмертных» клеток. Инкубация клеток сердца куриною эмбриона была начала 17 января 1912 г. Пересев клеток продолжил Эблинг, как он сам заявлял, работая с ними 34 года. Поскольку Каррель был хирургом и весьма сведущим в вопросах асептики, он смог внести существенный вклад в культивирование клеток животных in vitro. В то же время организация и технические условия проводимых экспериментов были очень громоздкими. Ассистенты Карреля были одеты в длиннополые резиновые халаты темного цвета с капюшонами для полного прикрытия головы. Процедуры были длительными и отягощенными многими деталями. В результате тех требований, которые выдвигались автором в отношении сложных мер предосторожности для предотвращения контаминации, вокруг данного предмета создалась атмосфера таинственности и исключительности, что скорее тормозило прогресс, чем способствовало ему. Тем не менее им было достигнуто многое. В частности, даже при отсутствии антибиотиков он добился успеха в пересадке клеток, используя хирургическую технику для отторжения отдельных колоний и переноса их в новые условия роста. Каррель также продемонстрировал своим коллегам научное значение тех наблюдений, которые могут быть сделаны в процессе пересадки клеток.

В ходе проделанных работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды культивирования. В частности, Тирод модифицировал раствор Рингера и в дополнение к куриной сыворотке и эмбриональному экстракту стал использовать коагулят фибрина. Для наблюдения за делящимися клетками животных Канти в 1928 г. разработал метод кинофотомикрографии. В этот же период был разработан дополнительный и очень существенный подход в технике работы с клетками. Имеется в виду применение трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся. Однако эта методика не находила признания до тех пор, пока в 1937 г. Симмс и Стидлман использовали ее для пассирования клеток между культурами плазмы. Эта методика дает возможность успешно применять в культурах индивидуальные клетки, а не ткани.

Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях. До тех пор пока в 1961 г. Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НДС) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Относительно линии WI-38 было показано, что период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50 удваиваниями популяции. Перед отмиранием популяции для клеток этой линии характерен феномен старения. Однако при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков злокачественных изменений. Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с гетероплоидностью. Первые суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей. Это - клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека. Перевиваемая линия карциномы шейки матки была выделена еще в 1952 году Джеем с сотрудниками, она используется и в настоящее время во многих лабораториях мира.

Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя новейшие открытия отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов, идентичных тем, которые найдены в таких известных онкогенных вирусах, как вирус саркомы Рауса и вирус саркомы Молони. Раус еще в 1910 году индуцировал опухоль, использовав профильтрованный экстракт куриной опухоли. Эта опухоль была индуцирована РНК-вирусом (вирус саркомы Рауса). Позднее было установлено, что ряд вирусов способен индуцировать возникновение опухолей, такие вирусы были названы онкогенными.

2. Введение в культуру животных клеток

Системы культивирования клеток

Существует 2 основных системы культивирования клеток.

1. Непроточные культуры – тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:

· прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);

· постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);

· перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).
Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.

Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток:монослойные культуры и суспензионные культуры.

Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:
1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.
5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

Недостатками монослойных культур являются:

· требования большого пространства;

· возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

· недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;

· сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.

Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления:

1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).

2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.

3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.

3. Клонирование животных

История клонирования

Американские исследователи С. Стик и Дж. Робл, используя методику МакГрата и Солтера, в 1988 г. получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8 клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора. В этих экспериментах только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Первые успешные эксперименты по клонированию сельскохозяйственных животных были проведены С. Уилладсином (S.Willadsen) в 1986 г. Он сливал безъядерные яйцеклетки с бластомерами, выделенными из 8 и 16-клеточного эмбриона овцы.

Дж. Робл и его сотрудники в1987 провели работы по пересадке ядер крупного рогатого скота. Они пересаживали в зиготы кариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2, 4 или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту – в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. С. Уиладсин (1989), в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров – окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

К. Бондиоли и соавторы (1990), используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены.

Экспериментов по клонированию свиней немного. Успешные исследования провели Р. Пратер с сотрудниками в 1989 г. Скудность данных, видимо, связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Я. Уилмута (Ian Wilmut) из Рослинского института получила клон овец – 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (G O) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы – окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, – значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное – овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали эмбриональные и фибробластоподобные клетки плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом – 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода – на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы – на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии G 0 и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Был использован метод электрослияния. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода – для двух и эмбриональные клетки – четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Аналогичные эксперименты проводили позднее Tanja Dominko и сотрудники лаборатории Висконсинского университета, которые обеспечили клонирование эмбрионов из клеток кожи ушей взрослого рогатого скота. Эмбрионы, генетически идентичные корове, пожертвовавшей клетки уха, были внедрены в матки коров – рецепиентов. Наблюдалась постепенная гибель эмбрионов, поэтому жизнеспособных телят не получили. Причины пока не установлены.

В августе 1997 года появилось сообщение о том, что Алан Троунсон (Австралия) разработал технологию, которая позволяет сформировать эмбрион из 16, 32 или 64 клеток и затем каждая из них может использоваться для формирования 16, 32 или 64 идентичных эмбрионов. Коллектив исследователей во главе с Аланом Троунсоном создал 470 генетически идентичных эмбрионов рогатого скота от единственной бластоцисты. Такая технология обеспечивает безграничный источник генетического материала для клонирования.

Несмотря на отсутствие немедленных практических результатов сделанного открытия, теоретическую значимость его трудно переоценить. Впервые было доказано, что гены запрограммированы обратимо. Дальнейшие исследования могут позволить понять, как регулируется работа генов, дифференциация клеток, почему клетки в одних случаях растут и размножаются управляемо, а в других (при раке) – неконтролируемо.

Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота, содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани (фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого белка. Несколько коров в настоящее время беременны трансгенными телятами. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную яйцеклетку рождается только 5 – 10% трансформированных животных, из них – несколько самцов, не дающих молока. Использование новой технологии клонирования позволяет получать животных только женского пола, дающих трансгенный протеин.

4. Технология трансплантации эмбрионов

Воспроизводство животных – это основной фактор, лимитирующий эффективность производства животноводческих продуктов на промышленной основе. Причины, препятствующие достижению оптимальных результатов в воспроизводстве домашнего скота различны. Новые методы расширяют возможности регулирования воспроизводства. Они связаны с манипулированием на уровне клеток или эмбрионов, с использованием физиологически активных соединений, поэтому названы биотехнологическими. К числу этих методов относят: стимуляцию и синхронизацию охоты, суперовуляцию, искусственное осеменение, трансплантацию эмбрионов, хранение гамет и эмбрионов, целенаправленное получение двоен, регулирование пола, раннюю диагностику беременности, управление процессом родов, создание химер и др.

Стимуляция и синхронизация охоты осуществляется с помощью прогестерона – женского полового гормона стероидной природы, регулирующего ход эстрального цикла, простагландинов, а также их комбинации. Этот прием позволяет вызывать появление охоты у групп племенных животных в один и тот же период времени.

В США для синхронизации охоты у телок в молочном и мясном скотоводстве выпускается новый препарат под названием “Синхро-мейт-В”. Он представляет совокупность двух гормонов, один из которых имплантируется под кожу, а другой инъецируется внутримышечно. Имплант помещается под кожу уха телки и сразу же после этого следует инъекция другого гормона. Под действием этих двух гормонов эстральный цикл телки прерывается и временно останавливается. Через некоторое время имплант удаляют из уха животного, начинается новый эстральный цикл. Так как имплант удаляется одновременно у всех телок, то и цикл начинается в одно и то же время.

Применение гормональных препаратов снимает необходимость ежедневного контроля за состоянием половой активности животных. Преимущество синхронизированной охоты состоит в реальной возможности формирования однородных групп животных в период осеменения, одновременности рождения приплода, точном учете кормов в группах.

Суперовуляция

Потенциальные возможности воспроизводства самок млекопитающих огромны. В их яичниках содержатся десятки и сотни тысяч овоцитов. Однако в процессе онтогенеза лишь небольшая часть из них реализуется в виде потомков. Остальные овоциты подвергаются атрезии (обратному развитию) и воспроизводстве не участвуют.

Суперовуляция – состояние, вызванное гормонами, когда в яичниках животных развивается и овулирует в несколько раз больше яйцеклеток. В зависимости от вида число овулирующих яйцеклеток может быть увеличено в 3 – 8 и даже в 50 раз. С помощью этого приема становится возможным получение большего количества эмбрионов от лучших по продуктивности коров.

Искусственное осеменение

Искусственное осеменение животных является самым старым и хорошо отработанным биотехнологическим методом разведения сельскохозяйственных животных. Применение этого метода позволяет ограничить распространение половых инфекций, которые нередко служат причиной бесплодия животных. Оно также позволяет эффективно использовать генетический потенциал лучших производителей. Экономический эффект от искусственного осеменения обусловлен снижением затрат на содержание большого поголовья производителей, возможностью быстрого размножения генотипа с хозяйственно – полезными признаками, улучшением генетического потенциала ремонтного стада.

Трансплантация эмбрионов

Трансплантация эмбрионов в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем в области животноводства. С помощью пересадки эмбрионов можно резко увеличить выход числа потомков от высокопродуктивных коров. Трансплантация эмбрионов, или эмбриотехнология, заключается в получении одного или нескольких эмбрионов из матки племенных животных (доноров) и пересадке в матку коров (рецепиентов), где эмбрионы развиваются до отела. Этот метод в сочетании с суперовуляцией у доноров позволяет получить большое потомство от высокопродуктивных животных. Этим способом эмбрионы можно внедрить в ту или иную породу в другие регионы, используя в качестве рецепиентов коров мясных пород. Применение этого метода также упрощает обмен генофондом сельскохозяйственных животных между странами и континентами. Пересадка эмбрионов может быть использована для получения потомства от ценных, но бесплодных коров, утративших способность к размножению в результате несчастного случая, болезни или по возрасту.

Когда было установлено, что кролик обладает иммунитетом по отношению к ящуру, была выдвинута идея использования метода трансплантации для оздоровления потомства зараженных ящуром животных. Половые пути кролика, куда трансплантируются эмбрионы, способны разрушать вирус ящура в эмбрионах. Трансплантация может быть использована и для временного хранения эмбрионов. В яйцеводах крольчих удается осуществлять трансконтинентальную перевозку эмбрионов овец.

Извлечение эмбрионов до 70-х годов производили в основном хирургическим путем, впоследствии он был заменен менее травматичным и трудоемким нехирургическим, основанным на введении в матку особого зонда по естественному каналу. Зонд имеет три канала. Один из каналов предназначен для надувания баллончика, который закупоривает рог матки, препятствуя вытеканию жидкости. По другому каналу вводится физиологический раствор с температурой 25-30 о С, который вымывает эмбрионы и возвращается вместе с ними через третий канал зонда в пробирку, помещенную в водяную баню с температурой 35 о С. Из этой жидкости извлекаются эмбрионы. В среднем при суперовуляции от донора можно получить от 5 до 7 эмбрионов.

Трансплантацию производят с помощью специального зонда или пистолета для осеменения. Эмбрионы помещаются в рога матки. Стельность у самок – рецепиентов проверяется по уровню прогестерона в плазме крови на 21-й день.

Регулирование пола. В практике разведения животных очень важно научиться управлять образованием в потомстве мужских и женских особей. Метод разделения эмбрионов по полу основан на определении белков, специфичных для самцов. Этом метод широко применяется в животноводческой практике многих стран. В Канаде уже с 1975 года рождаются телята, разделенные по полу на стадии эмбрионов. В перспективе для целенаправленного получения особей мужского или женского пола может быть применен метод микрохирургической замены Х и У хромосом. Такие манипуляции уже проводились на растительных клетках и яйцеклетках земноводных.

Современные биотехнологии в животноводстве Выполнила ученица 10 «Б» класса Суханова Вера Преподаватель Жирнова Л. Е.

Что такое биотехнология животных? На настоящий момент биотехнологии приобретают все более важную роль в повышении доходности животноводства. Внедрение результатов биотехнологических исследований в животноводство происходит в первую очередь в следующих областях деятельности: 1. Улучшение здоровья животных с помощью биотехнологии;2. Новые достижения в лечении людей с помощью биотехнологических исследований на животных;3. Улучшение качества продуктов животноводства с помощью биотехнологии;4. Достижения биотехнологии в охране окружающей среды и сохранении биологического разнообразия.Биотехнология животных включает в себя работу с различными животными (скотом, домашней птицей, рыбой, насекомыми, домашними животными и лабораторными животными) и исследовательскими приемами – геномикой, генной инженерией и клонированием.

Биотехнология для улучшения здоровья животных На сегодняшний день, по оценкам специалистов, рынок биотехнологических ветеринарных средств составляет 2,8 миллиардов долларов США. Ожидается, что в 2005 году эта цифра возрастет до 5,1 миллиардов. На июль 2003 года на фармакологическом рынке было зарегистрировано 111 биотехнологических ветеринарных продуктов, в том числе убитых бактериальных и вирусных вакцин. Ежегодно ветеринарная промышленность инвестирует в исследования и разработку новых препаратов более 400 миллионов долларов США.

Примеры диагностики и лечения животных – биотехнология позволяет фермерам немедленно диагностировать с помощью тестов на основе ДНК-типирования и определения наличия антител следующие инфекционные заболевания: бруцеллез, псевдобешенство, понос, ящур, лейкоз птиц, коровье бешенство и трихинеллез;– в скором времени ветеринары получат в свое распоряжение биотехнологические средства для лечения различных заболеваний, в том числе ящура, свиной лихорадки и коровьего бешенства;– новые биологические вакцины используются для защиты животных от широкого спектра заболеваний, включая ящур, понос, бруцеллез, легочные инфекции свиней (плевропневмонию, пневмонический пастереллез, энзоотическую пневмонию), геморрагическую септицемию, птичью холеру, псевдочуму домашней птицы, бешенство и инфекционные заболевания выращиваемой в искусственных условиях рыбы;

Примеры диагностики и лечения животных – активная работа ведется над созданием вакцины против африканского заболевания скота, получившего название лихорадки Восточного побережья. В случае успеха эта вакцина станет первым препаратом для борьбы с простейшими и одновременно первым шагом на пути к разработке противомалярийной вакцины;– молекулярные методы идентификации патогенов, такие как геномная дактилоскопия, позволяют наблюдать за распространением заболевания внутри стада и от популяции к популяции и идентифицировать источник инфекции;– генетический анализ патогенеза заболеваний животных ведет к улучшению понимания факторов, вызывающих заболевания не только животных, но и человека, и подходов к контролю над ними;

Примеры диагностики и лечения животных – улучшенные с помощью биотехнологии сорта кормовых растений обеспечивают повышение питательности кормов за счет дополнительного содержания в них аминокислот и гормонов, приводящих к ускорению роста животных и повышению их продуктивности. Биотехнологические приемы позволяют повысить усвояемость грубых кормов. Ученые работают над новыми сортами растений с целью создания съедобных вакцин для сельскохозяйственных животных. В ближайшем будущем фермеры получат возможность кормить свиней генетически модифицированной люцерной, стимулирующей специфический иммунитет к опасной кишечной инфекции. – новые ДНК-тесты позволяют выявлять свиней, страдающих генетически обусловленным свиным стресс-синдромом, характеризующимся дрожанием и гибелью животных при воздействии стрессовых факторов; – передающиеся по наследству неблагоприятные признаки скота могут быть идентифицированы с помощью ДНК-тестов, в настоящее время использующихся в национальных селекционных программах в Японии. С их помощью можно выявить дефект адгезии лейкоцитов, характеризующийся повторяющимися бактериальными инфекциями, задержкой роста и гибелью в течение первого года жизни; недостаточность фактора свертываемости крови XIII; наследственные формы анемии и задержку роста крупного рогатого скота.

Руководители животноводческих хозяйств непосредственно заинтересованы в повышении продуктивности сельскохозяйственных животных. Их конечной целью является повышение количества продукции (молока, яиц, мяса, шерсти) без увеличения затрат на содержание поголовья. Увеличение мышечной массы с одновременным снижением количества жира в организме мясных животных с незапамятных времен является целью селекционеров. Повышение продуктивности скота Именно с нее началась селекция и постепенное уменьшение свиней.

1 способ повышение продуктивности скота Биотехнология помогает улучшить продуктивность скота с помощью различных вариантов селекционного разведения. Для начала отбираются особи, обладающие желаемыми характеристиками, после чего, вместо традиционного скрещивания, производится забор спермы и яйцеклето к и последующее экстракорпоральное оплодотворение. Через несколько дней развивающийся эмбрион имплантируется в матку суррогатной матери соответствующего вида, но необязательно той же породы.

2 способ повышение продуктивности скота В 2003 году был официально зарегистрирован первый проверенный с помощью метода полиморфизма одного нуклеотида (SNP – single nucleotide polymorphisms) геном крупного рогатого скота мясного направления. SNP-метод используется для идентификации генных кластеров, ответственных за формирование того или иного признака, например, за поджарость животного. После чего с помощью методов традиционной селекции выводятся породы, в данном случае, отличающиеся повышенной мускулистостью. Во всем мире ведется активная работа по секвенированию геномов различных животных и насекомых. В октябре 2004 года было объявлено об успешном завершении проекта по секвенированию коровьего генома (Bovine Genome Sequencing Project). В декабре 2004 года было также успешно завершено секвенирование генома курицы.

3 способ повышение продуктивности скота Для повышения продуктивности животных нужен полноценный корм. Микробиологическая промышленность выпускает кормовой белок на базе различных микроорганизмов - бактерий, грибов, дрожжей, водорослей. Богатая белками биомасса одноклето чных организмов с высокой эффективностью усваивается сельскохозяйственными животными. Так, 1 т кормовых дрожжей позволяет получить 0,4- 0,6 т свинины, до 1,5 т мяса птиц, 25-30 тыс. яиц и сэкономить 5-7 т зерна (Р. С. Рычков, 1982). Это имеет большое народнохозяйственное значение, поскольку 80% площадей сельскохозяйственных угодий в мире отводятся для производства корма скоту и птице. Производство кормового белка на основе одноклето чных - процесс, не требующий посевных площадей, не зависящий от климатических и погодных условий. Он может быть осуществлен в непрерывном и автоматизированном режиме.

Биотехнологии в животноводстве набирают всё большую популярность. Это обстоятельство обусловлено всё возрастающей нагрузкой на АПК . Во многих странах сложилась непростая ситуация с обеспечением населения продуктами питания , что дало существенный толчок к поиску решений по увеличению эффективности предприятий АПК .

При этом, есть несколько подходов к решению данной проблемы, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. Все большую популярность сегодня набирает направление с использование генной инженерии. Организмы, получаемые в результате генетических модификаций, более устойчивы к заболеваниям, не боятся засухи и более продуктивны. Существенным недостатком использования данной технологии, является недостаточность проведенных исследований по их безопасности, а имеющиеся данные крайне противоречивы!

Исходя из вышесказанного, мы рекомендуем обратить Ваше внимание на совершенно иное направление в , которое является абсолютно безопасным, а в условиях России — единственно верным! Использование природных механизмов, с применением микроорганизмов, активных вытяжек из растений и грибов — это направление не ново, но получило новый импульс в последние 5-10 лет. Продукты получаемые с использованием данной методики — безопасны, т.к. при выращивании не использовались чужеродные химические и (внедрение генетического материала с получением ГМО ). Для России, с ее уникальными природными богатствами, данный метод является единственно правильным. Современные биотехнологии , способны значительно уменьшить издержки и повысить эффективность.

Сегодня разработаны биопрепараты для животных и методики их применения для различных направлений животноводства . С успехом используются микробиологические препараты , значительно увеличивающие прирост массы, укрепляющие защитные реакции организма, восстанавливающие микробный баланс в желудочно-кишечном тракте. Помимо этого, разработаны технологи, позволяющие значительно улучшить качество .

Большой проблемой для сельхозпроизводителей является — навоз КРС, подстилочный материал, птичий помет и прочее. Для этой области животноводства, также разработаны микробиологические препараты, которые перерабатывают отходы в биогумус в очень короткие сроки(2-4 недели, вместо 3-5 лет). Это позволяет значительно упростить процесс утилизации, получить ценное удобрение и избавиться от уплаты экологических штрафов.

Использование биотехнологии позволяет решать большое количество задач, направленных на улучшение генотипа сельскохозяйственных животных.

Главными разделами биотехнологии являются генная и клеточная инженерия.

Методы генной инженерии наиболее детально разработаны на микроорганизмах. Разработаны методы, позволяющие направленно изменять генотип микроорганизмов. В отличие от мутаций эти изменения можно планировать.

Для этого следует выделить определенные гены из генома одних животных и встроить их в геном других особей. Так, уже ген саматотропин – гормон роста крысы встроен в геном мыши, в результате резко усилены темпы роста реципиента и увеличилась его конечная живая масса .

Встройка интерферона (интерферон, англ. – препятствовать, мешать, продукт клеток, возникший при заражении вирусом, задерживающий развитие инфекции другими вирусами) в организм животных является важнейшим фактором формирования неспецифической резистентности организма; в результате его действия создаются препятствия развития другой инфекции (интерференция вирусов), препятствует заболеваниям и увеличивает резистентность организма.

В связи с этим представляется возможность по заранее намеченному плану реконструировать геном скота, придать ему заранее заданные свойства. Совершенно очевидно, что для достижения таких результатов традиционными методами потребовалась бы работа в течение многих поколений.

Большую важность представляет разработка методов извлечения из яичников коров-доноров яйцеклеток , культивирования, оплодотворения созревших ооцитов in vitro и последующего их раннего развития, а затем трансплантация (пересадка) коровам реципиентам. При этом генно-инженерные манипуляции (приемы работы, требующие большой точности) проводятся на фазе зиготы.Трансплантация, ранних эмбрионов основана на ускорении процессов размножения потомков ценных коров доноров. Для этого по определенной системе производят оплодотворение яйцеклеток in vitro и вымывание зигот (эмбрионов на 7-8-й день), которые пересаживают коровам-реципиентам. За год получают от донора 10–20 эмбрионов, которые можно заморозить, а затем осуществлять пересадку коровам-реципиентам, пришедшим в охоту. Техника пересадки уже отработана и дает возможность увеличить темпы селекции крупного рогатого скота в 10–20 раз и более.Используя трансплантацию эмбрионовможно вести борьбу с инфекционными заболеваниями (бруцеллез, лейкоз). Здоровая небеременная матка больных коров подавляет размножение бактерий и позволяет от инфицированных коров получать здоровое потомство.

На основе трансплантации можно предотвратить вымирание и полное исчезновение редких видов, пород животных ; пересаживая эмбрионы от таких животных реципиентов других пород, можно сохранить редкие породы. Примером может служить спасение от полного вымирания ангорской породы овец в Австралии.

Можно быть уверенным, что в ближайшей перспективе будут созданы новые формы крупного рогатого скота, обладающего рядом уникальных свойств, полученных методами генной инженерии (закономерности конструирования in vitro рекомбинантных молекул ДНК и их поведение в реципиентной клетке). Уже накоплен большой опыт культивирования соматических клеток животных т in vitro, разработаны способы длительного хранения клеток при низких температурах.

Активно проводятся исследования и по культивированию генеративных клеток.

Большое значение приобретает и метод агрегации ранних эмбрионов . Соединение двух целых эмбрионов от разных родителей позволяет получать животных, несущих качества сразу четырех родителей. Эти животные получили название химер . В настоящее время получены межвидовые (овца-коза) и межпородные химеры. В Германии (Брем) получили новое животное из двух половинок эмбрионов, взятых от животных разных пород. У нас в стране также получены химерные особи скота.

Определение пола эмбриона основано на идентификации половых хромосом, полученных методом биопсии раннего эмбриона. Этот метод уже используется на скоте. Трансплантация двух эмбрионов заведомо дает возможность избежать бесплодия телок из разнополых двоек (фримартинизм). Представляется возможным создание банка эмбрионов с заранее определенным полом, что позволит более рационально использовать генетические ресурсы.

Клонирование или получение идентичных близнецов из соматических клеток. В США, с помощью микрохирургии, получают клетки из внутренней части плаценты и каждое соматическое клеточное ядро трансплантируют в яйцеклетку, из которой заранее удалено ее собственное ядро. При этом из яйцеклеток развиваются идентичные близнецы, копирующие донора соматических клеток.

Крупномасштабная селекция и биотехнология в скотоводстве находятся в стадии становления. Эффективность их освоения позволит резко повысить продуктивность крупного рогатого скота.

Что такое биотехнология животных?

На настоящий момент биотехнологии приобретают все более важную роль в повышении доходности животноводства. Внедрение результатов биотехнологических исследований в животноводство происходит в первую очередь в следующих областях деятельности:

1. Улучшение здоровья животных с помощью биотехнологии;
2. Новые достижения в лечении людей с помощью биотехнологических исследований на животных;
3. Улучшение качества продуктов животноводства с помощью биотехнологии;
4. Достижения биотехнологии в охране окружающей среды и сохранении биологического разнообразия.

Биотехнология животных включает в себя работу с различными животными (скотом, домашней птицей, рыбой, насекомыми, домашними животными и лабораторными животными) и исследовательскими приемами – , .

Как регулируется создание генетически модифицированных животных продуктов?

Приказы регулятивных органов по поводу биотехнологии животных рассматриваются Управлением по разработке политики в области науки и техники с целью согласования деятельности правительственных органов для обеспечения рационального научного подхода. Несмотря на огромное количество разрабатываемых продуктов, регуляторных документов в печатном виде существует не так много.

В 2003 году Центр ветеринарной медицины FDA опубликовал предварительную версию руководства по оценке риска при клонировании скота и безопасности употребления пищевых продуктов, произведенных из мяса клонированных животных. Специалисты FDA пришли к выводу о пригодности мяса и молока клонированных животных к употреблению в пищу. Следующим шагом является полное урегулирование вопросов по оценке риска и предложений по процессу управления рисками.

Биотехнология для улучшения здоровья животных

На сегодняшний день, по оценкам специалистов, рынок биотехнологических ветеринарных средств составляет 2,8 миллиардов долларов США. Ожидается, что в 2005 году эта цифра возрастет до 5,1 миллиардов. На июль 2003 года на фармакологическом рынке было зарегистрировано 111 биотехнологических ветеринарных продуктов, в том числе убитых бактериальных и вирусных вакцин. Ежегодно ветеринарная промышленность инвестирует в исследования и разработку новых препаратов более 400 миллионов долларов США.

Сельскохозяйственные животные: скот и домашняя птица

Биотехнология обеспечивает принципиально новые подходы к улучшению здоровья животных и продуктивности скота и домашней птицы. Это улучшение возможно за счет усовершенствования диагностики, лечения и профилактики заболеваний; использования высококачественных кормов, производимых из трансгенных сортов кормовых растений; а также за счет повышения эффективности выведения новых пород.

Современная ветеринарная промышленность обладает огромным набором средств для профилактики и лечения заболеваний, потенциально способных вызвать эпизоотию и гибель сельскохозяйственного поголовья. Своевременная диагностика и лечение в комбинации с активными профилактическими мерами способствует снижению затрат на производство продуктов питания, а также улучшению состояния здоровья животных в целом и, соответственно, повышению безопасности пищевых продуктов.

– биотехнология позволяет фермерам немедленно диагностировать с помощью тестов на основе ДНК-типирования и определения наличия антител следующие инфекционные заболевания: бруцеллез, псевдобешенство, понос, ящур, лейкоз птиц, и трихинеллез;
– в скором времени ветеринары получат в свое распоряжение биотехнологические средства для лечения различных заболеваний, в том числе ящура, свиной лихорадки и коровьего бешенства;
– новые биологические вакцины используются для защиты животных от широкого спектра заболеваний, включая ящур, понос, бруцеллез, легочные инфекции свиней (плевропневмонию, пневмонический пастереллез, энзоотическую пневмонию), геморрагическую септицемию, птичью холеру, псевдочуму домашней птицы, бешенство и инфекционные заболевания выращиваемой в искусственных условиях рыбы;
– активная работа ведется над созданием вакцины против африканского заболевания скота, получившего название лихорадки Восточного побережья. В случае успеха эта вакцина станет первым препаратом для борьбы с простейшими и одновременно первым шагом на пути к разработке противомалярийной вакцины;
– молекулярные методы идентификации патогенов, такие как , позволяют наблюдать за распространением заболевания внутри стада и от популяции к популяции и идентифицировать источник инфекции;
– генетический анализ патогенеза заболеваний животных ведет к улучшению понимания факторов, вызывающих заболевания не только животных, но и человека, и подходов к контролю над ними;
– улучшенные с помощью биотехнологии сорта кормовых растений обеспечивают повышение питательности кормов за счет дополнительного содержания в них аминокислот и гормонов, приводящих к ускорению роста животных и повышению их продуктивности. Биотехнологические приемы позволяют повысить усвояемость грубых кормов. Ученые работают над новыми сортами растений с целью создания съедобных вакцин для сельскохозяйственных животных. В ближайшем будущем фермеры получат возможность кормить свиней генетически модифицированной люцерной, стимулирующей специфический иммунитет к опасной кишечной инфекции.
– исследователи работают над вакциной, которая могла бы послужить альтернативой кастрации скота. Телят кастрируют с целью снижения агрессии, а поросят – во избежание появления специфического запаха, делающего несъедобным мясо некастрированных кабанов. Новая вакцина обеспечит стерилизацию животных без хирургического вмешательства, не оказывая при этом негативного влияния на рост животных.

Кроме диагностических тестов, вакцин и лекарственных препаратов, использующихся для поддержания здоровья сельскохозяйственных животных, биотехнология играет все более важную роль в выведении новых пород. Методы генетического картирования позволяют выявлять генетически устойчивых к различным заболеваниям животных и использовать их в селекционных проектах для получения здорового устойчивого к болезням потомства. С другой стороны, животные с генетическими дефектами также могут быть идентифицированы и изъяты из процесса селекции.

– новые ДНК-тесты позволяют выявлять свиней, страдающих генетически обусловленным свиным стресс-синдромом, характеризующимся дрожанием и гибелью животных при воздействии стрессовых факторов;
– передающиеся по наследству неблагоприятные признаки скота могут быть идентифицированы с помощью ДНК-тестов, в настоящее время использующихся в национальных селекционных программах в Японии. С их помощью можно выявить дефект адгезии лейкоцитов, характеризующийся повторяющимися бактериальными инфекциями, задержкой роста и гибелью в течение первого года жизни; недостаточность фактора свертываемости крови XIII; наследственные формы анемии и задержку роста крупного рогатого скота.

Повышение продуктивности скота

Руководители животноводческих хозяйств непосредственно заинтересованы в повышении продуктивности сельскохозяйственных животных. Их конечной целью является повышение количества продукции (молока, яиц, мяса, шерсти) без увеличения затрат на содержание поголовья. Увеличение мышечной массы с одновременным снижением количества жира в организме мясных животных с незапамятных времен является целью селекционеров.

Биотехнология помогает улучшить продуктивность скота с помощью различных вариантов селекционного разведения. Для начала отбираются особи, обладающие желаемыми характеристиками, после чего, вместо традиционного скрещивания, производится забор спермы и яйцеклеток и последующее экстракорпоральное оплодотворение. Через несколько дней развивающийся эмбрион имплантируется в матку суррогатной матери соответствующего вида, но необязательно той же породы.

Иногда эмбрион делится на несколько частей, каждая из которых имплантируется отдельно. Такая форма клонирования на протяжении уже нескольких десятилетий используется для быстрого улучшения генетических характеристик сельскохозяйственных животных.

Методы геномики также используются для усовершенствования традиционных селекционных подходов. В 2003 году был официально зарегистрирован первый проверенный с помощью метода полиморфизма одного нуклеотида (SNP – single nucleotide polymorphisms) геном крупного рогатого скота мясного направления. SNP-метод используется для идентификации генных кластеров, ответственных за формирование того или иного признака, например, за поджарость животного. После чего с помощью методов традиционной селекции выводятся породы, в данном случае, отличающиеся повышенной мускулистостью. Во всем мире ведется активная работа по секвенированию геномов различных животных и насекомых. В октябре 2004 года было объявлено об успешном завершении проекта по секвенированию коровьего генома (Bovine Genome Sequencing Project). В декабре 2004 года было также успешно завершено секвенирование